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关于细胞凋亡的检测：主要问题是细胞凋亡判断标准和定量分析。前述任何一个指标单独使用，均不能准确的反映细胞凋亡的真实情况，将几种方法结合运用则可相互取长补短，较为jingque的定性、定量。因此，本研究采取多种方法联合应用，从不同角度证明细胞凋亡事件是否发生、发生的时期和严重程度。如：（1）检测细胞水平和亚细胞水平的形态学变化：用光镜可观察到细胞变小，胞质浓缩，核染色质浓缩并边缘化，核片段形成和凋亡小体形成；用电镜可观察超微结构的变化，如胞膜微绒毛变少和消失等。（2）根据生化指标变化：如 DNA 片段化的形成，应用原位缺口翻译技术（TUNEL）进行定性和定量检测。在定量分析时，DNA断裂点形成是目前Zui常用的判断标准，TUNEL是凋亡检测，特别是定量分析中Zui主要的方法。（3）利用分子生物学指标：主要指凋亡相关基因及其表达产物的检测。本研究选择多个促凋亡基因和抗凋亡基因同时检测，提高准确性；选择反映不同凋亡时期的Zui新检测指标，更jingque地帮助判断凋亡事件发生的早晚。（4）利用流式细胞术：流式细胞术是研究程序性细胞死亡时细胞许多特性的一种重要的定性、定量分析技术。当细胞凋亡时，细胞膜的通透性增加，小分子 DNA片段丢失，用 DNA特异性荧光染料进行染色后，凋亡细胞的染色程度下降，通过流式细胞仪进行 DNA 含量的检测，可以鉴定出凋亡的细胞。利用流式细胞术结合新的研究方法，还可分辨出早期凋亡和晚期凋亡的细胞，如进行 BALF中凋亡细胞磷脂酰丝氨酸外翻分析和凋亡细胞线粒体膜势能的检测等。技术关键在于：需保持检测标本呈单细胞悬液状态，不至于凝聚成团；活细胞与死细胞的鉴别以及早期凋亡和晚期凋亡细胞的鉴别，都需要不同的检测方法和不同的染色剂；在尚未照明细胞时触发仪器来进行检测以减少本底。

2、其他方面的技术关键问题：一方面，本课题组以往的研究已经积累了较为成熟的经验；另一方面，经过预初实验阶段的摸索基本可以解决

【可行性分析】

1、建立百草枯致肺纤维化动物模型的方法已十分成熟, 将SD大鼠作为实验动物以及用百草枯制作动物肺纤维化模型,目前为国内外学者普遍接受.本课题组前期研究已熟练掌握了该模型的制作方法.

2、补阳还五汤延缓肺纤维环的作用已经得到证实, 而且已用于急性粒细胞白血病的临床治疗, 其有效性和安全性已得到认可. 本课题组前期研究初步证实其可通过诱导肺内炎性细胞调亡而减轻百草枯所致的动物肺纤维化, 为本课题进一步研究奠定基础.

3、主要从诱导细胞凋亡角度探讨补阳还五汤作用机理, 联合应用多种方法从不同角度反映细胞凋亡事件的发生、发生时间、以及凋亡的程度. 本项目涉及的细胞凋亡定性和定量分析方法我校均有条件进行。

4、本课题组曾承担上海市科委资助课题，为本项研究做了大量的前期铺垫.

5、课题负责人有着较为丰富的研究经验和知识积累，在间质病研究领域有一定的学术地位.

6、课题组成员均有较为扎实的实验研究和临床研究基础，以往的研究已积累了较为成熟的经验。

基于以上几点我们认为：本课题设计切实可行、研究条件基本具备、准备工作充分、课题组成员配备合理，因此，完全有能力和条件完成本项研究。