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快速检测方法:
(1)近红外和傅里叶变换红外光谱法:
近红外和傅里叶变换红外光谱法是利用红外光线的穿透能力比较强,而试样中的含氢基团对不同频率的近红外光存在选择性吸收,因而透射的红外光就携带有有机物结构和组分的信息,通过检测器分析透射或反射光线的光密度就能确定该组分的含量。
优点是检测成本低,分析速度快;不需前处理,免去了化学反应中的诸多影响因素,也避免了对环境的污染;实现了样品的无损检测,并且能够对样品的多个组分同时检测。缺点是不适于痕量分析,灵敏度较比色法低,且需要建立相关的模型数据库,要大量的前期工作。
近红外检测技术应用于在线检测产品中的水分、蛋白质、脂肪含量等指标方面已有较成熟,包括粮食、肉制品、牛奶、调味品调味品、油脂、饮料、过氧化值水分、蛋白质、虫害感染等。
(2)放射测量法:
放射测量法是多种物理、化学诊断新技术。放射测量法的原理是根据细菌在生长繁殖过程中可利用培养基中的“C标记的碳水化合物或盐类的底物,代谢产生CO2,然后通过仪器测量CO2的含量增加与否,来确定样品中有无细菌存在。
优点是放射测量法较常规法(18-24h)快速、灵敏,适合大批量样品的细菌数检验,以及各类物品的无菌监测。目前,放射测量法应用于定量测量并同时用常规法计数细菌总数。
(3)阻抗法:
阻抗法的原理:微生物在生长过程中,可把培养基中的电惰性底物代谢成活性底物,从而使培养基中的电导性增大,培养物中的阻抗随之降低;同时,微生物在培养基中可产生具有作为诊断依据的特征性阻抗曲线,根据电阻改变图形,对检测的细菌做鉴定。
阻抗法应用于细菌检测、食品质量与病原体检测、工业生产中的微生物过程控制及环境卫生细菌学研究,如美国首台基于阻抗法的连续监测细菌代谢生长的仪器。
(4)化学比色分析法
化学比色分析法可分为利用普通化学原理与利用生物化学原理两大类。
化学比色分析法是根据食品中待测成分的化学特点,将待测食品通过化学反应法,使待测成分与特定试剂发生特异性显色反应,通过与标准品比较颜色或在一定波长下与标准品比较吸光度值得到Zui终结果。
目前常用的化学比色法包括各种检测试剂和试纸,两者都是利用迅速产生明显颜色的化学反应检测待测物质,可通过与标准比色卡比较进行目视定性或半定量分析,随着检测仪器的不断发展,与其相配套的微型检测仪器也相应出现。
化学比色分析法的优点是操作相对简便,结果显示直观,检测灵敏度高,适用一般家庭或农贸市场、超市快速检测调味品、调味品中有机磷农药残留量。不足之处是此类分析法会破坏食品,不能实现无损检测。以免疫传感器、PCR为代表的检测技术,虽然克服了传统方法检测周期较长的缺点,但也存在着各自的不足:如免疫学方法快速、灵敏度高,但容易出现假阳性、假阴性;基因芯片、蛋白质芯片准确性高、检测通量大,但制作费用太高,不利于普及。
目前,研制出的试纸条:有磷含量的农药速测卡、测硝酸盐的硝酸盐试纸条;速测仪有芥酸、油菜芥酸和硫糖苷的定量速测仪。在重金属的检测方面,试纸法有速检测环境中痕量重金属镉、汞的浓度试纸、快速检测食品中的霉菌纸片。
(5)生物芯片检测法
①免疫芯片:免疫芯片是一种特殊的蛋白芯片,芯片上的探针蛋白可根据研究目的选用抗体、抗原、受体等具有生物活性的蛋白质。芯片上的探针点阵,通过特异性免疫反应捕获样品中的靶蛋白,然后通过专用激光扫描系统和软件进行图像扫描、分析及结果解释,具有高通量、自动化、敏度高和多元分析等优点。由于单克隆抗体具有高度的特异性及亲和性,因此是一种比较好的探针蛋白,用其构筑的芯片可用于检测蛋白质表达丰度及确定新的蛋白质。
在免疫芯片的制作过程中,Zui关键的步骤是抗原或抗体的固定。根据固定原理可分为物理吸附法和共价结合法。物理吸附法简便易行,但固定的抗原分子数少,在以后的洗涤过程中,固定分子容易脱落,影响结果的判读。近年来免疫芯片的研制多采用共价结合法进行抗原或抗体的固定,常用的材料包括玻璃片、硅片、金片、聚丙烯酰胺凝胶膜、尼龙膜等。在众多的共价固定材料中,通常采用的是玻璃片及聚丙烯酰胺凝胶膜。采用聚丙烯酰胺凝胶膜固定抗原或抗体过程是通过光致聚合作用在玻璃片上制备众多彼此分开的聚丙烯酰胺凝胶膜,然后用戊二醛进行膜的活化,活化膜上的醛基和抗原或抗体中的氨基反应形成酰胺键,从而完成识别分子的固定,其优点是固定的识别分子数量大,在其上进行的抗原抗体反应近似于液相中的反应,反应速度快,信号强。
在免疫芯片中常用的标记物有放射性同位素、酶、荧光物质等,依据标记物的不同采用不同的检测方法。采用放射性同位素标记抗原或抗体具有特异性强、敏感性高的优点,但由于该方法放射性污染且需要专门的检测设备,其应用受到了一定的限制。采用酶及荧光物质(Cy3、Cy5)标记抗原或抗体具有敏感、简便、快速的优点,这两种标记方法克服了放射性同位素标记法的不足,已成为免疫芯片中常用的标记物,抗原与抗体反应结束后用扫描仪进行荧光信号的检测。
②基因芯片检测方法:基因芯片是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵列。基因芯片是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针,有规律地排列固定于支持物上形成的DNA分子阵列,其工作原理是根据碱基配对的原理来检测样品的基因,也就是利用已知序列的核酸对未知序列的核酸序列进行杂交检测。其检测致病菌原理为:选择细菌的共有基因(16SrDNA、23SrDNA、ERIC)作为靶基因,用一对通用引物进行扩增,再利用芯片上的探针检测不同细菌在该共有基因上的独特碱基,从而区分不同的细菌,此法还可以通过向寡核苷酸探针阵列中添加相应的探针来逐步扩大基因芯片的检测范围,并通过增加和调整探针来逐步提高基因芯片的准确性。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上,所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析。基因芯片技术检测水和食品中常见致病细菌及其毒素、真菌毒素、病毒、支原体、衣原体、立克次氏体等微生物战剂,具有快速、准确、易于操作等优越性,值得推广应用。
优点是自动化程度高,能够实现同时检测多种目标分子的目的,而且检测效率高,检测周期短。缺点是前期需要大量已测知的DNA片段信息,检测费用仍偏高。
生物芯片检测法应用于金黄色葡萄球菌、转基因食品、盐酸克仑特罗、链霉素、磺胺二甲嘧啶。聂萌运用通用芯片技术平台建立了快速、准确、高通量检测食源性致病菌的方法,对李氏菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、小肠结肠耶尔森氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、福氏、贺氏菌及A型产气荚膜菌进行检测,八种菌的Zui低检出限比各菌株相应的PCR检测灵敏度至少高出一个数量级。
(6)传感器检测技术
生物传感器是将生物感应元件的专一性与能够产生和待测物浓度成比例的信号传导器结合起来的一种分析装置,与传统的化学传感器和离线分析技术(如HPLC或MS)相比,生物传感器有着许多不可比拟的优势,如高选择性、高灵敏度、较好的稳定性、低成本、可微型化、便于携带、可以现场检测等,它作为一种新的检测手段正迅猛发展。根据生物识别元件和生物功能膜的不同,生物传感器可分为酶传感器、免疫传感器、微生物传感器、组织传感器、细胞器传感器、类脂质膜传惑器、DNA杂交传感器等。在现场快速检测领域,生物传感器检测技术与比色、免疫胶体金试纸、ELISA等检测方法相比还未得到普遍应用。
生物传感器应用于L-抗坏血酸、抗氧化剂、胆碱、谷氨酸盐、卵磷脂和亚硫酸盐测定。